解決方案 | Pyrolysis-GCMS定量分析貝殼類動(dòng)物中微塑料

劉石磊 鄭力賞

(北京3377官網(wǎng)儀器股份有限公司，北京 101318)

摘要： 介紹利用Pyrolysis-GCMS對(duì)貝殼類動(dòng)物進(jìn)行6種微塑料檢測(cè)。樣品前處理主要采用氫氧化鉀消解，結(jié)合液氮研磨方式對(duì)樣品濾膜進(jìn)行研磨均質(zhì)前處理。通過(guò)穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率考察，證明此方法能夠有效分析貝殼類動(dòng)物中微塑料含量。

關(guān)鍵詞：Pyrolysis-GCMS；微塑料；貝殼類動(dòng)物；液氮研磨

全球每年產(chǎn)生塑料垃圾數(shù)億噸，由于全球塑料排放嚴(yán)重，大量塑料顆粒進(jìn)入海洋生態(tài)系統(tǒng)。貝殼類動(dòng)物主要生活在海水中，這導(dǎo)致微塑料進(jìn)入貝殼動(dòng)物體內(nèi)，而人類在食用貝殼類動(dòng)物時(shí)，微塑料又進(jìn)入人體內(nèi)，則對(duì)貝殼類動(dòng)物體內(nèi)微塑料含量進(jìn)行測(cè)定很重要。

大于20μm的微塑料可以通過(guò)傅里葉變換紅外光譜和拉曼光譜分析，對(duì)小于20 μm的微塑料較難使用這兩種儀器分析。在這種情況下，熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜(Py-GCMS)是一種非常有效的分析手段。Py-GCMS沒(méi)有微塑料尺寸限制，觀察范圍取決于濾膜的孔徑，可以做到全覆蓋。PY-GCMS檢測(cè)不足是缺失塑料污染物的平均尺寸分布。使用Py-GCMS可以在一次分析中檢測(cè)多種微塑料，也大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

PY-GCMS分析方法使用堿性消解，結(jié)合液氮研磨方式，通過(guò)穩(wěn)定性、加標(biāo)回收考察，證明此方法是一種貝殼類動(dòng)物中微塑料定量分析的可靠方法。 

1.實(shí)驗(yàn)

1.1實(shí)驗(yàn)材料

樣品：市場(chǎng)采購(gòu)4種不同海洋類貝殼，分別為生蠔、蜆子、蛤蜊、扇貝。

    標(biāo)準(zhǔn)品： 聚乙烯(PE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯(PS)和聚丙烯(PP)， 均采購(gòu)自阿拉?。ㄉ蝦＃?。  聚苯乙烯(PS) 100μm粒徑標(biāo)準(zhǔn)品，采購(gòu)自輝質(zhì)生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

熱裂解儀采用熱絲(鉑線圈)加熱方式，Pyroprobe 6200，CDS Analytical公司；GC-MS為氣相色譜GC7890 結(jié)合質(zhì)譜MS-5975，安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

從市場(chǎng)采購(gòu)4種海洋貝殼類樣品，樣品去殼后，被轉(zhuǎn)移到裝有玻璃瓶蓋的30mL玻璃瓶中。加入預(yù)過(guò)濾的10%氫氧化鉀水溶液，加入量為1g肉加入80ml氫氧化鉀水溶液。利用10%氫氧化鉀消解，溫度為40℃消解24小時(shí)。氫氧化鉀水溶液采用預(yù)過(guò)濾，在直徑為25 mm、孔徑為0.45 μm的濾膜過(guò)濾(來(lái)自Sigma-Aldrich)，以去除任何潛在的塑料污染。將瓶置于搖床培養(yǎng)箱中，在40℃下連續(xù)攪拌(500 rpm) 48小時(shí)。用一個(gè)裝有氫氧化鉀溶液但沒(méi)有樣品的玻璃瓶作為方法空白。消化完成后，將樣品從培養(yǎng)箱中取出，

將樣品液在真空抽濾的石英濾膜上抽濾，石英濾膜（購(gòu)自whatman）的直徑25mm。

將濾膜放入5mL金屬研磨罐，加9.6mm金屬研磨球，擰緊蓋子。放入液氮中冷凍5min, 取出研磨罐放入研磨儀中，研磨儀參數(shù)設(shè)置為65Hz 40s ，進(jìn)行研磨，再放入液氮冷凍5min，然后研磨40s，如此共重復(fù)8次（研磨儀購(gòu)自上海凈信）。

取2mg（天平購(gòu)自Sartorius  Micro Balance）研磨稀釋后樣品放入熱裂解的樣品管中，樣品管放入熱裂解儀中，利用PY-GCMS進(jìn)行分析。

1.4 儀器參數(shù)

熱裂解參數(shù)：

熱裂解700℃  40s  ；Interface 300℃；閥箱300℃；傳輸線320℃

GC-MS參數(shù):

進(jìn)樣口320℃；50:1分流；色譜柱DB-5MS  30mx0.25mmx0.25μm

柱溫箱40℃保持2min ,10℃/min升到100℃， 50℃/min升到300℃，保持3min  ；柱流量1mL/min ；接口320℃； EI源； SCAN 35-600amu；離子源230℃；四極桿150℃；離子源EI 70ev ；溶劑延遲 0.5min

2.結(jié)果與討論

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

    微塑料的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作是難點(diǎn)，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線的幾個(gè)級(jí)別的樣品量為微克級(jí)別，天平難稱?。�韵娚用液氮研磨稀暑^椒ǖ玫較∈禿蟮謀曜計(jì)販勰?，可以進(jìn)行稱量。

實(shí)驗(yàn)采用硅藻土作為分散物質(zhì)，硅藻土主要為二氧化硅，對(duì)熱裂解譜圖背景影響小。事先將硅藻土在馬弗爐800℃ 燒2小時(shí)，去除硅藻土中雜質(zhì)。取2mg硅藻土進(jìn)行PY-GCMS空白考察，確定無(wú)雜質(zhì)峰出現(xiàn)，再作為實(shí)驗(yàn)中分散劑使用。

用天平分別稱取1mg各塑料，將6種塑料各1mg加入5mL金屬研磨罐，再加入0.15g硅藻土作為分散物質(zhì)。放入9.6mm金屬研磨球，擰緊蓋子。放入液氮中冷凍5min, 取出研磨罐放入研磨儀中，研磨儀參數(shù)設(shè)置為65Hz 40s ，進(jìn)行研磨。再放入液氮冷凍5min，然后研磨40s，如此共重復(fù)8次。得到微塑料在硅藻土中 的6667μg/g標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。 

分別取硅藻土分散的微塑料標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.66mg、0.97mg、1.48mg、1.97mg、2.44mg，放入熱裂解樣品管中，共5個(gè)級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，則對(duì)應(yīng)各微塑料質(zhì)量為4.4μg、6.47μg、9.87μg、13.13μg、16.27μg。 

利用PY-GCMS分析得到6種微塑料的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2>0.95，則標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。

表1.  標(biāo)注曲線數(shù)據(jù)

表2.  6種塑料定量和定性特征組分

2.2 液氮研磨參數(shù)優(yōu)化

    用天平分別稱取1mg各塑料，將6種塑料各1mg加入5mL金屬研磨罐，再加入0.15g硅藻土作為分散物質(zhì)， 放入9.6mm金屬研磨球，擰緊蓋子。放入液氮中冷凍3min, 取出研磨罐放入研磨儀中，研磨儀參數(shù)設(shè)置為50Hz 30s ，進(jìn)行研磨。再放入液氮冷凍3min，然后研磨30s，如此共重復(fù)4次。取2mg進(jìn)樣PY-GCMS，用穩(wěn)定性RSD來(lái)考察塑料研磨微顆粒和硅藻土分布均勻性是否滿足實(shí)驗(yàn)要求。

    每次取2mg，重復(fù)4次考察穩(wěn)定性。結(jié)果如下表：

表3.  連續(xù)4次進(jìn)樣的重現(xiàn)性RSD

    從表3數(shù)據(jù)可知，PE和PET的RSD不理想，需要優(yōu)化液氮研磨參數(shù)。則將液氮冷凍時(shí)間延長(zhǎng)到5min, 研磨震動(dòng)頻率增大為65Hz ，研磨時(shí)間增大為40s， 重復(fù)次數(shù)增大到8次。重新取樣研磨后得到數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4.  連續(xù)4次進(jìn)樣的重現(xiàn)性RSD

圖1.  連續(xù)4次進(jìn)樣的重現(xiàn)性譜圖

    由表4數(shù)據(jù)可知，6個(gè)塑料利用此優(yōu)化后的液氮研磨參數(shù)，得到RSD均較理想，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.3 加標(biāo)回收

從市場(chǎng)采購(gòu)聚苯乙烯PS微顆粒標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自輝質(zhì)生物），粒徑100μm，固含量1% 。取3個(gè)相同樣品，分別加入1μL，則加入量為10μg 。進(jìn)行同樣前處理和PY-GCMS分析，則加標(biāo)回收結(jié)果如表5，從結(jié)果可看出通過(guò)PS可得到加標(biāo)回收率82~85%較理想，方法檢測(cè)較準(zhǔn)確。

表5.  PS加標(biāo)回收率結(jié)果

2.4 質(zhì)量控制

須注意在取樣和實(shí)驗(yàn)室樣品制備過(guò)程中盡量減少污染。實(shí)驗(yàn)流程只使用玻璃和金屬器皿。器皿用水和乙醇清洗三次。在分析過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員穿著100%純棉制成的實(shí)驗(yàn)服。實(shí)驗(yàn)操作是在通風(fēng)柜中進(jìn)行的，以盡量減少空氣中微塑料的污染。當(dāng)樣品未處理時(shí)，儲(chǔ)存在封閉的玻璃單元中。所有溶劑(水、乙醇或氫氧化鉀溶液)在PTFE 濾膜(0.45 um來(lái)自Sigma-Aldrich)上預(yù)過(guò)濾。樣品管在使用前用熱裂解儀的1000℃ 燒30秒，待冷卻后放入樣品進(jìn)行測(cè)試。

2.5 樣品中微塑料含量

    在海洋生物中塑料含量與攝食方式、海洋棲息地或營(yíng)養(yǎng)狀況之間有一定關(guān)系[1]。微塑料是否從消化系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到組織或循環(huán)液中，微塑料是否只是短暫的在生物體中停留，則塑料顆粒的攝入、排出或排泄機(jī)制目前仍不清楚。樣品中主要含有的微塑料是聚乙烯PE和聚丙烯PP，PE通常以最大的比例存在，通常超過(guò)總微塑料量的80%。據(jù)報(bào)道，PE在海洋樣品中占主導(dǎo)地位，在海面上的平均比例為42% [2]。

圖2. 樣品測(cè)試結(jié)果

3.結(jié)論

利用Pyrolysis-GCMS建立分析海洋貝殼類動(dòng)物體內(nèi)的6種微塑料含量的方法。通過(guò)液氮研磨方式，稀釋6種微塑料標(biāo)準(zhǔn)品，并且建立標(biāo)準(zhǔn)曲線R2>0.95 ；考察液氮研磨的均勻性和穩(wěn)定性，重復(fù)進(jìn)樣RSD<5%；通過(guò)聚苯乙烯PS 100μm粒徑標(biāo)準(zhǔn)品考察加標(biāo)回收率，范圍為82~85%較理想；嚴(yán)格控制系統(tǒng)空白，測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確性更可靠；幾個(gè)樣品的測(cè)試結(jié)果，為主要含有聚乙烯PE為10~15μg/g,其次含量是聚丙烯PP為0~2μg/g 。則證明此Pyrolysis-GCMS方法可準(zhǔn)確有效的分析海洋貝殼類動(dòng)物體內(nèi)的6種微塑料含量

參考文獻(xiàn)：

[1] Carbery, M., et al., 2018. Trophic transfer of microplastics and mixed contaminants in the marine food web and implications for human health. Environ. Int. 115, 400–409.

[2] Erni-Cassola, G., et al., 2019. Distribution of plastic polymer types in the marine environment; a meta-analysis. J. Hazard. Mater. 369, 691–698.